Hier finden Sie meine Dissertation zum Thema "Signals and metabolic consequences during the interaction of Brassicaceae and Verticillium longisporum" angefertigt bis 2012 an der Georg-August-Universität in Göttingen im Fachbereich Pflanzenbiochemie in der AG von Prof. Ivo Feußner.

Zusammenfassung:

Das bodenbürtige, hemibiotrophe Pathogen Verticillium longisporum ist eine ernsthafte Bedrohung des Rapsanbaus (Brassica napus). Um effektive Abwehrmaßnahmen zu entwickeln, ist es notwendig die Pflanze-Pathogen-Interaktion gut zu verstehen. Diese Arbeit zielte daher darauf ab, metabolische Veränderungen und beteiligte Stoffwechselwege im pathogenen Pilz sowie in der befallenen Wirtspflanze aufzufinden und zu identifizieren. Dafür wurde ein „Metabolite Fingerprinting“-Versuchsansatz durch Anpassung der analytischen Parameter und der Extraktionsmethoden für die untersuchte Probenart optimiert. Um durch V. longisporum produzierte extrazelluläre Metabolite in Xylemgefäßen zu identifizieren, wurde ein in vitro Versuch etabliert. Dies führte zur Identifizierung von sieben Metaboliten aus dem Tryptophanmetabolismus, die in einer xylemartigen Umgebung akkumulieren. Keine der pilzlichen, in vitro produzierten Substanzen konnte jedoch in planta nach V. longisporum Infektion nachgewiesen werden. Daher wurden alle Substanzen, die sich in der Pflanze anreicherten, analysiert. Eine vergleichende Analyse der apoplastischen Flüssigkeiten und verschiedener Pflanzenorgane in einer Zeitspanne von 5 bis 35 Tage nach Infektion in B. napus zeigte eine starke Veränderung des Metabolitenmusters durch die Pilzinfektion. Die Identifizierung von ubiquitär akkumulierenden Infektionsmarkern führte zur Auffindung des Phytoalexins Cyclobrassinin und 22 verwandten, erstmals beschriebenen Substanzen. Die Aufklärung der Strukturen erfolgte über MS/MS und pseudo-MS/MS/MS Fragmentierung. Die Verteilung der Cyclobrassinin-verwandten Stoffe innerhalb der Pflanze korrelierte mit der pilzlichen DNA-Menge in den Pflanzenorganen. Dies deutet auf eine hohe Kontamination und eine starke Antwort auf Metabolitenebene im Hypocotylgewebe hin. Durch Kombination der erhobenen Strukturdaten mit einem vorgeschlagenen Stoffwechselweg für das Phytoalexin Camalexin in Arabidopsis thaliana konnte ein analoges Modell für den Biosyntheseweg von Cyclobrassinin erstellt werden. Eine Teilgruppe der infizierten Infektionsmarker deutet auf den Abbau von Cyclobrassinin zu 2-Mercapto-indol-3-carboxylsäure (MICA) Derivaten hin. Unter Einbeziehung von Proben von Camelina sativa – dessen Infektion mit V. longisporum in dieser Arbeit das erste Mal beschrieben wurde – und A. thaliana in die vergleichende Analyse von Brassicaceen, stellte sich heraus, dass andere Infektionsmarkergruppen verbreiteter auftreten als die artspezifischen, Cyclobrassinin-verwandten Substanzen. Raphanusamsäure (RA), eine vermutlich mit dem Phytoalexin- oder Glucosinolat-Stoffwechsel verwandte Substanz, Pipecolinsäure und drei glycosylierte Derivate der Salicylsäure (SA) akkumulierten in den drei Brassicaceen. Zwei Trihydroxyfettsäuren wurden als Infektionsmarker in den apoplastischen Flüssigkeiten von B. napus und A. thaliana identifiziert. Weiterhin wurden fünf Infektionsmarkergruppen ausschließlich in der Apoplastischen Waschflüssigkeit (AWF) identifiziert. Gesättigte Dicarbonsäuren und ihre Monoamid-Derivate sind Infektionsmarker in B. napus und A. thaliana. Zudem wurden in B. napus Anreicherungen der Diamid-, Aldehyd- und Alkohol-Derivate gefunden. Die Mono- und Diamide wurden eindeutig durch chemisch synthetisierte Standards bestätigt. In einer gerichteten Analyse wurden zudem drei Polyamine als Infektionsmarker festgestellt. Glucosinolate hingegen, die oft in Pflanze-Pathogen-Interaktionen beteiligt sind, waren in B. napus keine verlässlichen Infektionsmarker. Vorläufige Ergebnisse eines Raps-Priming-Experiments mit Azelainsäure (C9-Dicarbonsäure) deuten nur eine Verschiebung in der Cyclobrassinin-Biosynthese an, aber keine gesteigerte Resistenz gegenüber V. longisporum. Ein infektionsähnliches Metabolitenmuster konnte nicht durch Flotation auf verschiedenen Infektionsmarkern wie SA oder RA erzeugt werden. Die Behandlung von B. napus Blättern mit CuCl2 zeigte, dass es sich bei den Cyclobrassinin-verwandten Substanzen um pflanzliche Stoffe handelt. Sie akkumulieren in Raps ebenso wie RA, SAG und Pipecolinsäure nach biotischem wie auch abiotischem Stress.

In der Summe wurden mehr als 70 Metabolite eindeutig identifiziert. Dabei handelt es sich entweder um pilzliche Substanzen, die in in vitro Versuchen akkumulieren oder um pflanzliche Substanzen in Brassicaceen nach Infektion mit V. longisporum.

Summary:

The soil-borne, hemibiotrophic pathogen Verticillium longisporum is a severe threat for oilseed rape (Brassica napus) cultivation. In order to develop effective, defensive treatments for infected plants a thorough understanding of the plant-pathogen interaction is necessary. Therefore this work was conducted to find and identify metabolic changes and involved metabolite pathways in the pathogenic fungus or in the invaded host plant. For that a metabolite fingerprinting approach was optimized by adjusting the analytical parameters and adapting extraction methods to the analysed types of samples. In order to identify extracellular metabolites that are produced by V. longisporum in the xylem vessel, an in vitro assay was established resulting in the identification of seven metabolites from the tryptophan metabolism that accumulates in a provided xylem like environment. Nevertheless none of the identified substances produced by the fungus in vitro was detectable in planta after V. longisporum infection. Hence all accumulating metabolites in planta were analysed. A comprehensive analysis of apoplastic fluids and different plant organs in a time course from 5 to 35 days past infection in B. napus revealed a strong change in the metabolite pattern caused by V. longisporum infection. The identification of ubiquitously accumulating infection markers resulted in the detection of the phytoalexin cyclobrassinin and 22 related newly described substances. Structure elucidation was performed by MS/MS and pseudo-MS/MS/MS fragmentation analysis. The distribution of the cyclobrassinin related compounds within the plant correlated with the amount of fungal DNA detected in the plant organs pointing to a high contamination and a strong metabolic response in the hypocotyl tissue. By combining the obtained structural information and a proposed pathway for the phytoalexin camalexin in A. thaliana an analogue model for the biosynthetic pathway of cyclobrassinin is proposed. A subgroup of the identified infection markers hints to a degradation of cyclobrassinin resulting in 2-mercapto-indole-3-carboxylic acid (MICA) derivatives. When samples from Camelina sativa – whose infection process with V. longisporum was accessed for the first time in this work - and Arabidopsis thaliana were included in the comprehensive analysis of Brassicaceae it was found, that other groups of infection markers are more general than the species specific cyclobrassinin related markers. Raphanusamic acid (RA), a substance putatively related to phytoalexin or glucosinolate metabolism, pipecolic acid and three glycosylated salicylic acid (SA) derivatives proved to accumulate in the three Brassicaceae. Two trihydroxy fatty acids were identified infection markers from apoplastic fluids of B. napus and A. thaliana. Furthermore five groups of infection markers were identified exclusively in the apoplastic wash fluid (AWF). The saturated dicarboxylic acids and their monoamide derivatives are infection markers in B. napus as well as in A. thaliana. Furthermore diamides, aldehydes and alcohol derivatives were found to accumulate in B. napus plants. The mono- and diamide derivatives were unequivocally identified by chemically synthesized authentic standards. Three polyamine infection markers were additionally measured in a targeted analysis whereas the glucosinolates often involved in plant-pathogen interactions were not found to be reliable infection markers in B. napus. Preliminary results from a priming experiment of B. napus with the C9 dicarboxylic acid, azelaic acid, indicated only a shift in cyclobrassinin biosynthesis but no enhanced resistance to V. longisporum infection. An infection resembling metabolite pattern could not be achieved by flotation on several identified infection markers like SA or RA. The elicitation of B. napus leaves with CuCl2 demonstrated that the cyclobrassinin related substances were plant derived substances. They as well as markers like RA, SAG and pipecolic acid accumulate upon biotic and abiotic stress in B. napus.

In summary more than 70 metabolites were unequivocally identified either as fungal substances that accumulate in in vitro assays or as plant-derived metabolites in Brassicaceae upon V. longisporum infection.

Download Full-PDF