Hier finden Sie meine Diplomarbeit "Biochemische Charakterisierung von potentiellen Substraten der plastidären HSP90/HSP70-Chaperone" angefertigt 2006/2007 an der Albert-Ludwigs-Universität in Freiburg im Fachbereich Biochemie bei Prof. Michael Schroda.

Zusammenfassung:

Im Chloroplasten von Chlamydomonas sorgen J-Domänen-Proteine für eine spezifische Auswahl von Substraten für das Hitzeschockprotein HSP70B. Wird CDJ2, eines dieser Cochaperone, heterolog in E.coli exprimiert, erfolgt nach dem Induktionszeitpunkt ein dramatischer Wachstumsstopp der Bakterien. Dies geht mit einer Abnahme des Gesamtproteins von bis zu mehr als 30 % innerhalb von drei Stunden einher. Um die Ursache dieser außergewöhnlich starken Wachstumshemmung zu ergründen, sollten mit CDJ2 interagierende Proteine bestimmt werden. Zusammen mit dem J-Domänen-Protein konnte in einem Ni-NTA „Pulldown-Assay“ ein Protein angereichert werden, das mit Massenspektrometrie als SecA identifiziert wurde. Mit einem Antikörper gegen SecA aus E.coli konnte die Interaktion zwischen bakteriellem SecA und plastidärem CDJ2 mit einem immunologischen Nachweis bestätigt werden. Für eine Detektion von SecA aus Chlamydomonas war der Antikörper jedoch nicht geeignet, so dass eine Klonierung des plastidären SecA in ein bakterielles Expressionssystem notwendig wurde. Diese wurde erfolgreich durchgeführt und soll im Anschluss an diese Arbeit zur Gewinnung des Proteins und der Herstellung von polyklonalen Antikörpern verwendet werden.
Mehrere Ni-NTA Proteinanreicherungen mit verschiedenen Triton-Konzentrationen zeigten eindeutig eine Störung der Interaktion zwischen CDJ2 und SecA durch das Detergenz. Zudem konnte gezeigt werden, dass SecA in E.coli nicht durch die Überexpression von CDJ2 induziert wird.
Durch die Klonierung und heterologe Expression von N-terminal deletierten Versionen von CDJ2 konnte ein 43 Aminosäuren langer Sequenzabschnitt als potentielle Interaktionsstelle zwischen CDJ2 und SecA ausgemacht werden. Dieser Sequenzabschnitt ist ausreichend, um den Wachstumsstopp in E.coli auszulösen. Auch das CDJ2-Homolog aus Arabidopsis (AtCDJ2) wurde in E.coli kloniert und exprimiert. Eine Verbindung zwischen AtCDJ2 und SecA konnte bis jetzt jedoch noch nicht festgestellt werden.
Die Interaktion zwischen SecA und CDJ2 lässt einen Zusammenhang zwischen dem HSP70-Chaperonsystem und dem Sec-Translokationssystem in Chloroplasten erwarten.

In einem weiteren Teilabschnitt dieser Diplomarbeit konnten zwei Proteine als potentielle Interaktionspartner des HSP70/HSP90-Chaperonsystems ausgeschlossen werden. Die mit den Arbeitsnamen VAP und 70-kDa-Protein bezeichneten Proteine ließen sich über Co-Immunopräzipitationen nicht zusammen mit VIPP1 und HSP70B aus den Chloroplasten von Chlamydomonas anreichern. Bei dem potentiellen Substrat von HSP90C, einer Thioesterase, konnte aufgrund des unzureichenden Antikörpers keine endgültige Aussage erreicht werden.

Weiterhin wurde zur Untersuchung der Funktion von HSP90C im Chloroplasten eine Unterexpression durch RNAi durchgeführt. Charakteristische Phänotypen, bedingt durch das Fehlen des Chaperons, konnten jedoch weder auf Protein- noch RNA-Ebene festgestellt werden.

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